注:
1. 标本性状标记代码:干酪痰“1”; 血痰“2”; 黏液痰“3”;唾液“4”。
2.在所选标本后“结果观察”栏记录每支罗氏培养基培养结果。培养基斜面无菌落生长,报告培养阴性,标记“-”;菌落生长不及斜面面积1/4时,报告实际菌落数;菌落占斜面面积 1/4,报告(1+);菌落占斜面面积 1/2;报告(2+);菌落占斜面面积 3/4,报告(3+);菌落布满培养基斜面,报告(4+); 污染,报告“C”。
附件11
全国第五次结核病流行病学抽样调查细菌学检查工作细则
有肺结核可疑症状者或胸部X线检查发现异常阴影者应进行痰涂片检查和痰结核分枝杆菌培养,培养阳性标本作菌种初步鉴定和药物敏感性试验。
一、痰标本收集、保存和运送
(一) 流调全程中各省(自治区、直辖市)应指定专人负责痰标本的检查工作。
(二) 应收集受检人员三份痰标本:即时痰、夜间痰和清晨痰,依次编成1、2和3号。
即时痰即受检人在症状调查或摄胸片时留置的痰标本,或者是送检夜间和晨痰两份痰标本即时留置的痰标本;夜间痰为受检对象在送痰时前夜留置的痰标本;清晨痰为受检对象在送痰时当日清晨留置的痰标本;无痰受检人应采用雾化诱痰等方法留取标本。
受检人应得到流调人员的指导,以便得到合格的痰标本。应记录痰标本性状: 干酪痰、血痰、黏液痰和唾液四类,前三种为合格痰标本。如果经过指导,受检人不能获得合格痰,唾液也应进行检查。留置的痰量应为3-5毫升;痰标本不合格时,应指导重新留取。难以获得合格标本时,留置的标本也应进行细菌学检查。
(三) 留痰容器采用可密封的、带螺旋盖的不渗漏容器,省参比室统一准备、分发,由流调队员在明显位置标明受检人姓名和受检者编号。
(四) 待检痰标本应于冷暗处密封放置,勿倒置容器。涂片检查后,标本应立即置4℃保存,冷链运输,尽快进行结核分枝杆菌培养。
二、生物安全及实验地点选择
(一) 标本采集与保存
受检人应在远离人群的开放场所或通风良好的专用留痰室留痰,留取后不能立即进行检测的应在普通冰箱冷藏保存。
(二) 标本运输
标本和菌株运送过程中按照《
可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》的要求进行包装、运输、操作、保藏和管理。
(三) 实验操作
各流调点的实验室操作由具有相关专业知识和操作技能的工作人员进行,实验人员应严格遵循规范化的操作程序进行各项操作。
(四) 废弃物处理
将废弃物高压蒸汽灭菌(条件:121摄氏度,15分钟)后,按照《
医疗废物管理条例》的相关规定妥善处理。
(五) 实验室选择
在满足检验要求的条件下,尽可能选择接近流调点的实验室。
1. 涂片实验室基本条件
一个独立房间,有上下水及电的供应,通风和照明良好 ,至少具备通风柜(或生物安全柜)、冰箱(冷藏柜),如果能当天运送标本至培养实验室,也可不配备冰箱。
2. 培养实验室基本条件
在涂片实验室的基础上,具备II级生物安全柜、涡旋振荡器、恒温培养箱。由流调队协调安排培养所需的房舍和设备。
三、痰涂片检查
痰涂片操作及质量保证:按现行《中国结核病防治规划-痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》规定,采用痰标本直接涂片、萋-尼氏热染色法。
镜检后,登记涂片结果、涂片日期等相关信息;每张涂片应分别用镜头纸去镜油,以2B铅笔在磨砂面注明受检人姓名、试验序号,按流水号置于玻片盒中,然后将玻片盒置于阴凉处避光保存。
流调点使用的染色液由省参比实验室统一提供。
全部痰片应单独保留,供省和国家参比实验室检查验收。
如果涂片和培养不在一个实验室进行操作,在现场未结束时,涂片、培养使用两本流调细菌学实验室登记本(附件10)分别进行登记结果;培养实验室在培养前将标本有关涂片信息誊写到培养用登记本上。
四、结核分枝杆菌培养
所有痰涂片受检者均应进行结核分枝杆菌培养。培养实验室由流调队协调在具备实验条件的实验室进行。如果县(区)和地(市)级实验室人员不具备培养能力,由省级参比室下派实验员进行结核分枝杆菌培养。
(一) 标本选择
1. 3份痰标本均为阳性:选取阳性级别高的2份痰标本进行培养;
2. 3份痰标本2份阳性:选取2份阳性痰标本进行培养;
3. 3份痰标本1份阳性:选取阳性标本和1份质量好的阴性标本进行培养;
4. 3份标本均为阴性:选取标本性状好的2份痰标本进行培养;
5. 3份标本均为阴性且性状大致相同:选取晨痰和夜间痰进行培养。
应按照国家标本运送相关规定,拟进行培养的标本在留取后6天之内冷链运输至培养实验室,在留取后7天内必须进行结核分枝杆菌培养。
(二) 痰分离培养
应使用省参比室统一提供的酸性改良罗氏培养基,本次调查采用氢氧化钠处理直接接种酸性罗氏培养基方法(简单法)。
1. 设备材料
(1)II级生物安全柜
(2)恒温培养箱
(3)涡旋振荡器
(4)前处理管
(5)无菌吸管(每份标本需要一支吸管)
(6)试管架
(7)废液缸(内盛不腐蚀高压灭菌器的消毒液或水)
(8)废弃物袋
2. 试剂
(1)4%氢氧化钠(NaOH)溶液
(2)酸性改良罗氏培养基
3. 环境、设备、材料准备
(1)将酸性罗氏培养基从冷藏环境中取出,室温下放置;
(2)接通生物安全柜电源,预热3分钟;
(3)将患者姓名标记在前处理管上;
(4)待酸性罗氏培养基恢复至室温,在培养管斜面的背面标记患者姓名、实验序号、接种日期。
4. 操作步骤
(1)对照标记的姓名,在生物安全柜内将约2ml标本置于相应前处理管中;
(2)旋紧痰标本容器螺旋盖;
(3)使用吸管,将与痰标本等体积4% NaOH加入前处理管中;
(4)旋紧处理管螺旋盖,将处理管置于试管架内;
(5)接通涡旋振荡器电源,将处理管在涡旋振荡器上涡旋震荡30秒左右;
(6)将前处理管置于试管架内,置于生物安全柜内,室温静置15分钟;
(7)拧开罗氏培养管螺旋盖,检查培养基斜面底部的凝固水,如果凝固水过多,则沿着斜面相对的一面的培养管内壁,将凝固水弃去;
(8)以无菌吸管吸取前处理后的痰标本,吸取接近结束时,将吸管口移出液面,继续松开吸管气泡端,使吸管前端一段不含液体,以减少液体意外滴落的风险;
(9)保持培养基斜面水平或底端略低,接种时第一滴液体接种至斜面中部,第二滴接种到培养基上部;每支培养基使用接种0.1-0.15ml(约2滴);
(10)将用过的吸管置于废液缸内;
(11)旋上培养管螺旋盖,不要太紧;
(12)轻轻转动并放低培养管底部,使接种的液体均匀的在斜面上铺开;
(13)将培养基放置在斜面放置架上,保持培养基斜面水平向上;
(14)重复步骤8-步骤13,直至全部培养基接种完毕;
(15)连同斜面放置架将培养基置于恒温培养箱内,36±1℃孵育;
(16)24小时后,拧紧培养管螺旋盖,直立放置,36±1℃条件下继续孵育。
5. 登记与报告
(1)接种后第3和7日观察培养情况,此后每周观察一次,直至第八周末。如果第3日或第7日发现有污染,应嘱受检人重新留痰进行培养。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。
(2)肉眼判定:结核分枝杆菌的典型菌落形态为:不透明淡黄色、粗糙、干燥、凸起于培养基、有的成菜花样。如果发现培养基液化、或者长霉菌,则报告污染(登记本标记“C”)。
(3)根据肉眼的初步判定,按以下生长情况记录结果:
无菌落生长 报告培养阴性,标记“-”
菌落生长不及斜面面积1/4时 报告实际菌落数
菌落占斜面面积 1/4 报告(1+)
菌落占斜面面积 1/2 报告(2+)
菌落占斜面面积 3/4 报告(3+)
菌落布满培养基斜面 报告(4+)
污染 报告“C”
培养登记本样式见附件,调查结束后,培养结果登记本复印件应上交国家参比室。
所得全部分离株应4℃妥为保存,并尽快进行菌株运送。国家参比室经次代培养后进行药物敏感性测定,并以鉴别培养基作分枝杆菌种初步鉴定。
五、药物敏感性测定
(一) 所有分枝杆菌分离株应作抗结核药物敏感性测定。
(二) 药物敏感性测定采取比例法,药物敏感性测定所用培养基采用无淀粉改良罗氏鸡卵培养基,经蒸汽凝固器85℃蒸汽凝固50分钟。
(三) 作药物敏感性测定的抗结核药物应避光、密闭、干燥、-20℃保存。根据药物的生物效价折算后准确称重。
(四) 本次流调检测的药物有:异烟肼(INH),利福平(RFP),乙胺丁醇(EMB),链霉素(SM),对氨基水杨酸(PAS),卡那霉素(KM),氧氟沙星(OFLX)。
(五) 各药物的临界浓度为:INH0.2ug/ml,RFP40ug/ml,EMB2ug/ml,SM4ug/ml,PAS1ug/ml,KM30ug/ml,OFLX2ug/ml。
(六) 药敏试验方法
刮取合适菌龄的次代培养物斜面上各部分菌苔,置玻璃研磨器中研磨。加入灭菌生理盐水与1号麦氏标准管比浊成 1mg/ml菌悬液。 稀释至指定浓度 , 分别接种10
-4 mg、10
-6 mg 于各含药培养基和无药培养基斜面上。36℃培养,保持斜面水平向上24小时后直立培养,4周观察结果,并记录生长情况。菌落可数时,应记录实际菌落数。菌落超过50个以(+)表示, 50-100为(+),100-200为(2+),200-500(大部分融合)为(3+),500以上(全部融合)为( 4+)。
比例法结果判定:耐药百分比大于1%时,则认为受试菌耐药。
药敏试验操作需在II级生物安全操作柜内进行。培养4周后报告结果。
(七) 质量控制
每批药物敏感测定应作结核分枝杆菌H
37Rv对照。
六、菌种初步鉴定
本次调查仅使用对硝基苯甲酸(PNB)培养基进行菌种初步鉴定。
(一) 鉴别培养基
对硝基苯甲酸(PNB)培养基:用少许丙二醇溶解 PNB后,用灭菌蒸馏水适量稀释,加入改良罗氏培养基中混匀,使PNB最终浓度为 0.5mg/ml, 分装试管后置培养基蒸汽凝固器85℃凝固灭菌50分钟。
(二) 接种和结果报告
与药物敏感测定同时进行。接种10
-2mg/ml次代培养物菌悬液0.1ml,36℃培养。四周报告结果。根据对照培养基、PNB培养基生长情况,判定和报告结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。
七、流调分离株的保存、运送
各流调点的全部分离株的原代培养物短时保存应置于4℃条件下,由省参比实验室集中流调点的分离株的原代培养管2支,及时送国家参比室进行敏感性测定和菌种的鉴定。除送2支培养管至国家参比室外,其余培养管应由省级参比室进行传代,留在省级实验室的原代培养管和次代培养管应置于-20℃中保存,防止后期污染。
如果仅有2支阳性培养管,则送至国家参比室1支培养管,另1支按上述方法传代并冻存。
如果仅有1支阳性培养管,则由省级参比室将该培养管进行传代4支中性罗氏培养基,待生长良好后送2支培养管至国家参比室。
八、数据资料收集、保管、报告和分析的内容
培养登记本(含涂片结果)验收时上交复印件至国家参比室。
细菌学分析内容:总耐药率、初始耐药率、获得性耐药率、耐多药(MDR) 率、初始耐多药率、获得性耐多药率。
九、质量保证
(一) 痰涂片检查的质量保证
1. 实验员应接受相关专业培训。
2. 按照《中国结核病防治规划-痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求做好各项实验室检查的室内质量控制工作。
3. 痰标本在涂片之后培养之前,应放入冰箱冷藏备用。
4. 调查期间的全部涂片验收时上交。
(二) 结核杆菌培养的质量保证
调查期间应固定1-2名接受过培训的实验员进行分离培养,并严格按照本手册规定的标准操作程序操作,做好室内质量控制。
培养基的质量保障:省级统一提供,各流调点收到培养基后先观察培养基的颜色、表面状况等,并将培养基于36℃放置48小时,如发现污染,则弃去不用;未污染的培养基放置4℃冰箱保存,并在有效期内使用,过期的培养基不允许继续使用。
1. 培养箱温度的保障:培养箱内的实际温度应保持35℃-37℃之间。
2. 问诊医生和/或实验员应就留痰注意事项向受检对象宣教,保证受检对象留取足量的、合格的痰标本。
3. 实验员收到受检对象痰标本后,应尽快进行涂片检查,在等待镜检结果时,痰标本应进行冷藏。
4. 培养物的保存:阳性培养管4℃直立保存。
5. 培养结果判定:本次调查的培养结果由省级实验室人员进行确认。
培养基上有培养物生长时,除非培养基液化或有大量霉菌生长,其它情况均须在省级实验员确认后才可进行处理,以保证阳性培养物不被看作污染物而进行高压灭菌。
6. 评价指标:
涂阳培阴率:统计、分析未用药受检人涂片阳性培养阴性情况,公式如下:
未用药受检人涂阳培阴率=
| 未用药涂片阳性培养阴性的受检人数
| ×100%
|
未用药涂片阳性的受检人总数
|
污染率,统计、分析污染率,公式如下:
公式:污染率=
| 污染的培养管数量
| ×100%
|
培养管总数
|
如果未用药的受检人涂阳培阴率大于10%,或者污染率大于5%,应报告省级参比室,及时整改。
(三) 药物敏感性试验的质量保证
1. 为避免不同实验室之间的药物敏感性试验结果差异,本次调查中的药敏试验由国家结核病参比实验室承担。
2. 固定经过培训且熟练度测试结果合格的实验员进行药物敏感性试验。
3. 含药培养基在有效期内使用。
4. 每批含药培养基以结核分枝杆菌H37Rv为对照。
5. 为保证试验质量和实验员安全,药物敏感性试验每人每天不超过20株。
6. 菌株送至国家参比室时,均应进行二次传代,待3-4周后进行药物敏感性测定。
7. 培养箱温度的保障:培养箱的温度应在35℃-37℃之间。
8. 全部药敏试验结束后,随机抽取10%菌株进行复验。
(四) 菌株运送
1. 菌株运送前
各流调点分离到阳性培养物后,及时从36℃培养箱转移到4℃暂时保存,并尽快报告省参比实验室。省参比实验室到流调点核对实验室分离培养结果记录本与培养管,准确填写菌株运送标签与菌株运送表,与阳性培养物一同送到国家结核病参比实验室,运送前要暂时保存于4℃。
2. 菌株运送
菌株运送由省级参比实验室承担,运送时要使用符合相关规定的专用菌株运送箱,必要时(运送环境温度可能高于36℃时)在运送箱内放入制冷剂,并遵守卫生部《
可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》,由经过专门培训的有菌株运输资质的人员进行运送。
3. 菌株运送后
阳性分离培养物由流调点运输到省参比室后,若不能立即运送到国家参比室,应在生物安全柜内打开菌株运输箱,将培养物放置于4℃冰箱暂时保存。培养物送到国家参比室后,同样在生物安全柜内打开菌株运输箱,观察有无泄漏发生,尽快传代培养进行药物敏感性试验。
十、实验室设备耗材要求
(一) 涂片设备耗材要求
设备、耗材的技术要求见《中国结核病防治规划-痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》,由省级统一提供。
(二) 培养设备耗材要求
设备要求参见《全国结核病耐药性基线调查实施手册》附件中“各调查点主要设备技术参数”内容。
培养基要求
酸性改良罗氏培养基由省级统一提供,使用省级参比室制备的或者获得药监局批准的商业化培养基。酸性改良罗氏培养基制备程序如下:
1.试剂与含量
按下表所列的各组份比例,准备所需试剂。制备培养基所需化学试剂应使用分析纯纯度。另准备70-75%酒精约200毫升用于鸡蛋表面消毒。
改良罗氏培养基组分与含量(以配制一个全量培养基为例)
成份
| 酸性改良LJ
|
无机盐成分
| 磷酸二氢钾(KH2PO4)
| 14g
|
硫酸镁(MgSO4 ·7H20)
| 0.24 g
|
枸橼酸镁Magnesium citrate
| 0.6 g
|
L-天冬酰胺(L-Asparagine)或谷氨酸钠(Sodium glutamate)
| 3.6 g/7.2 g
|
丙三醇(Glycerol)
| 7.2 g
|
蒸馏水
| 600 ml
|
鸡蛋匀液
| 1000 ml
|
孔雀绿Malachite green (2%)
| 20 ml
|
孔雀绿水溶液配制方法:称取孔雀绿染料2g,加蒸馏水或去离子水至100 ml使用无菌技术溶解染料于灭菌的蒸馏水或无菌去离子水中(放置于37°C温箱中1-2小时)或者在水浴中加热。配制好的溶液储存于深色瓶中。此溶液长时间放置并不稳定,如果发生沉淀,应丢弃并重新配制。
2.培养基制备准备
(1)盐溶液
将称取的无机盐置于已高压灭菌的2000ml烧瓶中,加入600ml 去离子水制备成盐溶液。沸水浴或煮沸30分钟,也可进行121°C灭菌15分钟。
(2)用肥皂水清洁鸡蛋,然后流水冲洗后,用70%酒精擦洗消毒,晾干。
3.培养基制备
(1)将消毒晾干的新鲜鸡蛋打入灭菌的容器内,使用打蛋器或搅拌器进行匀化;
(2)用无菌的2层纱布过滤匀化的鸡蛋液;
(3)量取需要的体积(1个全量为1000ml)鸡蛋液加到盐溶液中;
(4)加入2%孔雀绿溶液20ml,缓慢混合;
(5)分装培养液至培养管中,每管约7 ml;
(6)将培养管放在斜面架上,使培养基斜面占试管长度2/3,放在已预热的蒸汽凝固器中,待凝固器温度升至85°C,开始计时,凝固50分钟;
(7)将试管从蒸汽凝固器中取出,冷却至室温时旋紧螺旋盖;
(8)根据培养基质量控制的要求检查外观,合格的培养基则进行下一步操作。
4.无菌测试
(1)抽取5%的培养基,置于恒温培养箱内,36
+1°C孵育;
(2)48小时后观察是否有细菌生长;
(3)如果测试的任何一支培养基未发现有培养物生长,即为无菌测试合格;
(4)如果测试的任何一支培养基有培养物生长,则将同一批次的所有培养基置于36
+1°C孵育48小时,逐一检查培养基,弃去有细菌生长的培养管,没有培养物生长的培养管保存备用;
(5)填写无菌测试记录,保存记录备查。
5.保存
培养基无菌测试合格后,将培养管直立放在塑料袋或者容器内后扎紧密封,置于冷藏环境中避光保存。
6.储存和运输
(1)储存
在4°C条件下,培养基储存于密闭的袋子中,用于培养的酸性改良罗氏培养基保存期限不超过3个月。
(2)运输
1)培养基尽可能冷藏运送,在环境温度下可短时运送,但要避免极端温度(超过40℃或低于0℃);否则应有保温措施。
2)运送过程中确保不受阳光的照射。
附件12
全国第五次结核病流行病学抽样调查细菌学检查结果单
受检者编号:
姓名:
性别:
年龄:
1. 痰涂片检查结果(结果摘自细菌学实验室登记表):
1A:涂片标本1检测结果: □
(1)阳性 (2)阴性
1B:涂片标本2检测结果: □
(1)阳性 (2)阴性
1C:涂片标本3检测结果: □
(1)阳性 (2)阴性
摘录人员签名:
记录时间:2010年
月
日
2. 痰标本是否送培养检查:(1)是 (2)否
3.痰培养检查结果(结果摘自细菌学实验室登记表):
3A:涂片标本1培养检测结果: □
(1)阳性 (2)阴性 (3)污染 (4)未使用
3B:涂片标本2培养检测结果: □
(1)阳性 (2)阴性 (3)污染 (4)未使用
3C: 涂片标本3培养检测结果: □
(1)阳性 (2)阴性 (3)污染 (4)未使用
摘录人员签名:
记录时间:2010年
月
日
附件13 全国第五次结核病流行病学抽样调查疑似肺结核患者简要病历
(推荐作为临时记录使用,非正式病历)
姓名
受检者编号
性别:男
女
出生日期:
年
月
日
主诉:
|
现病史:
肺部阳性体征:
|
既往结核病诊断和治疗情况:无 有 (如有,填下列项目)
首次确诊日期: 年 月
抗结核治疗史: 正在治疗 未治疗 已治愈 未治愈
|
既往史:
卡介苗接种史: 有 无
与结核病患者有无密切接触:有 无
|
医师签名:
日期:2010年
月
日
附件14
全国第五次结核病流行病学抽样调查肺结核患者病例卡
受检者编号:
姓名:
性别:
1. 病例发现种类:(l)新发现 (2)已知在治 (3)已知未在治 □
2.流调细菌学检查结果: □
2.1痰涂片检查:(1)涂阳 (2)涂阴 (3)未查
2.2 痰培养检查:(1)培养阳性 (2)培养阴性 (3)污染 (4)未查
3. 胸部X线检查结果: □
3.1 空洞:
(l)有 (2)无 (3)可疑 □
3.2 病变部位: □
左:(1)有 (2)无 若有,请标明:上、中、下
右:(1)有 (2)无 若有,请标明:上、中、下
4. 诊断分类: □
(1)原发性肺结核 (2)血行播散性肺结核 (3)继发性肺结核
(4)结核性胸膜炎 (5)其他肺外结核
5. 卡介苗接种史:(1)有 (2)无 (3)不详 □
6. 与结核病患者的密切接触史:(1)有 (2)无 (3)不详 □
7. 既往结核病诊断情况: (1) 无 (2)有 (如有,填下列项目) □
8. 抗结核治疗史:(1)从未化疗(跳) (2)接受过化疗 □
9. 如接受过化疗,其用药情况: □
9.1异烟肼: (1)用药<1个月 (2)用药≥ 1个月 (3)未用
9.2 利福平: (1)用药<1个月 (2)用药≥ 1个月 (3)未用
9.3 利福喷丁:(1)用药<1个月 (2)用药≥ 1个月 (3)未用
9.4 链霉素: (1)用药<1个月 (2)用药≥ 1个月 (3)未用
9.5乙胺丁醇:(1)用药<1个月 (2)用药≥ 1个月 (3)未用
9.6 吡嗪酰胺:(1)用药<1个月 (2)用药≥ 1个月 (3)未用
调查员签名:
流调队负责人签名: